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本制品是专门用于乙酸-尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳（AU-PAGE）的试剂盒，适用于分离等电点偏碱性的各种碱性蛋白，如嗜中性防御素、酪氨酸酶、鱼精蛋白、组蛋白以及这些碱性蛋白的各种修饰形式（如乙酰化、泛素化等），电泳后可直接用于考染、银染、Western杂交等实验。

• 一站式，即开即用，用户不需单独准备各种成分，十分方便。
  
• 采用不连续胶系统，分辨率高，能有效分离只有一个修饰基团不同的组蛋白。
  
• 使用光激发剂，故不需要进行长时间的预电泳。

1. 60%丙烯酰胺母液：加160mL自备去离子水到装有丙烯酰胺干粉的250mL棕色瓶中，终于体积为250mL。充分摇晃溶解（不能加热）。一次没用完的本溶液可以放4℃长期保存。
   
2. 2.5%甲叉双丙烯酰胺母液：加100mL自备去离子水到装有甲叉双丙烯酰胺干粉的120mL本色瓶中，摇晃溶解（不能加热）。没用完的需4℃保存。
   
3. 8M尿素母液：用本试剂盒提供的尿素干粉和自备的去离子水配制8M的尿素母液。如果配制10mL，则将4.8g尿素溶于少量水中，最后定容到10mL。没用完的本溶液需放-20℃保存，避免产生氰酸根离子。
   
4. 待电泳的蛋白样本必须没有离子，故最好先用3500Da截留的透析袋在2.5%乙酸溶液中充分透析，然后分装成5～50μg/管，冷冻抽干。也可以用三氯乙酸沉淀，丙酮洗涤去盐离子。本试剂盒不提供相关试剂。

5. 下表是配制0.1×14×14cm大小PAGE胶所需各成分的用量。由于常见的碱性蛋白组蛋白和鱼精蛋白分子量都比较小，因此需用4%的浓缩胶浓度和15%的分离胶浓度。若胶大小变化或者碱性蛋白分子量较大，所配制的胶的体积和浓度需要相应调整。在两个容器中分别加入下列成分：
   

   成分	15%分离胶	4%浓缩胶
   60%丙烯酰胺溶液	8.6mL	0.67mL
   2.5%甲叉双丙烯酰胺溶液	1.4mL	0.64mL
   乙酸	2.1mL	0.57mL
   尿素	16.8g	4.8g
   去离子水	至33mL	至9.3mL

6. 灌分离胶：按上表配制分离胶，将溶液摇晃混匀，然后用真空泵接上管子抽真空15分钟去除溶液中的氧气，然后加入125μL氨水、175μL TEMED和2.38mL光激发剂，迅速摇匀并灌胶，在分离胶的液面距离胶板顶部5cm的时候，停止灌胶。加入1mL去离子水。由于分离胶比重较大，水将覆盖分离胶并使得胶面平整。将胶板放在强光下（如看X光片的灯箱前）促进光激发剂活动。室温聚合30～60分钟。凝固后倒出水，插入梳子。
   
7. 灌浓缩胶：按上表配制分离胶，将溶液摇晃混匀，然后用真空泵接上管子抽真空15分钟去除溶液中的氧气，加入35μL氨水、50μL TEMED和650μL光激发剂，迅速摇匀并灌胶。将胶板放在明亮处，促进光激发剂活动。室温聚合30～60分钟。浓缩胶的高度有1～2cm即可。

8. 在等待胶凝固的过程中，配制上样液：在1.5mL塑料离心管中，加入7.7mg上样液成分1，0.9mL 8M尿素母液，50μL pH指示剂，50μL氨水。混匀后即得上样液。上样液只能现配现用，没有用完的不需要保留。
   
9. 浓缩胶凝固后，拔出梳子，取出胶下面的隔条，将胶板上架到电泳槽上。先在下槽加入1×AU-PAGE电泳缓冲液。上槽的电泳缓冲液待上样后再加。
   
   • 1×AU-PAGE电泳缓冲液由本试剂盒提供的10×AU-PAGE电泳缓冲液稀释而来，在1倍体积的10×AU-PAGE电泳缓冲液中加入9倍体积的去离子水，混匀后即可。1×AU-PAGE电泳缓冲液可以重复使用3次。
10. 在第4步制备的冷冻干燥的蛋白样本中每管加入上步制备的上样液40μL，室温溶解5分钟。为避免尿素修饰蛋白，溶解时间不要超过5分钟。如果加入样本后，溶液不是粉红色，则表示蛋白样本中有残留乙酸使得pH过低，蛋白溶解不充分，需要补加氨水调到颜色变成粉红色，恢复碱性。
    
11. 上样前每管补加2.5μL乙酸进行酸化，再加2μL AU-PAGE电泳示踪剂，补水到总体积为50μL。
    
    • 补水多少取决于第10步加入了多少氨水调pH。
12. 将50μL（含5～50μg总蛋白质）全部上样，多余的加样孔中要加入空白样本（40μL上样液+2.5μL乙酸+2μL AU-PAGE电泳示踪剂+5.5μL去离子水）以平衡电泳时各加样孔的盐离子浓度。
    
13. 小心在上槽加满新鲜配制的AU-PAGE电泳液。加入了AU-PAGE电泳液后的凝胶必须立即使用，不得放置。
    
14. 接电源线：AU-PAGE的电泳方法跟SDS-PAGE相反，故正极需要接到上槽，负极需要接到下槽。碱性蛋白在电泳体系中带正电，向负极移动。
    
15. 固定电压到300 V电泳，如果是小的胶，可以固定电压到250 V电泳。在电泳过程中电流将逐渐降低。整个过程在常温操作，不能在低温操作。
    
16. 当电泳示踪剂快到胶的边缘时停止电泳。
    
17. 对AU-PAGE胶进行考染（本试剂盒不含考染相关试剂）：将5g考马斯亮蓝R-250溶解在500mL脱色液（20%甲醛，7%乙酸）中，如果有不溶解的颗粒可以过滤去除，放入AU-PAGE胶后摇晃1小时。然后在脱色液（20%甲醛，7%乙酸）中脱色直到调条带显现。
    
    • 常见的碱性蛋白Histone和鱼精蛋白分子量都比较小，故不能使用固定步骤。